뉴스포럼
커뮤니티뉴스포럼

제목 [뉴스포럼 3호] 정기칼럼: 임상지침
작성자 관리자 작성일 2018-08-13 11:34:43 조회수 394
첨부파일

체성유전자 변이(somatic variant) 확인을 위한 혈액암 패널의 검증 가이드라인  

김혜진 (명지병원 진단검사의학과)

 

 

최근 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing; NGS) 기술이 발전함에 따라 다양한 암종과 관련한 somatic variants에 대한 mutational profiles이 밝혀지고 있으며 진단, 예후, 그리고 치료에 적극적으로 활용되고 있습니다. 특히, 혈액암과 관련한 targeted gene panel의 임상 검사실 도입에 대한 요청이 여러 기관에서 이뤄지고 있고, 이미 패널을 만들어 검사를 하고 있거나 계획 중에 있습니다. 하지만, 대부분의 기관에서는 NGS 검사법 자체에 대한 어려움과 동시에 까다로운 검증 과정에서부터 많은 장애물에 부딪히게 됩니다. 또한, 기존에 발표되었던 2017년 CAP/AMP 가이드라인[1] 등의 해외 가이드라인을 참고로 할 수 있으나 국내 검사실에 모두 적용하기에는 현실적으로 어려움이 따르므로 좀 더 실제적으로 적용할 수 있는 검증 방법을 모색할 필요가 있습니다.  

 

먼저 패널을 직접 디자인하는 경우 도입 목적에 따라 임상의와의 합의를 통해 임상적으로 유의미한 유전자 및 확인하고자 하는 유전자 부위(target region)가 패널에 포함되어야 하며, 반드시 해당 유전자 부위 특성을 파악하여야 합니다. 이는 데이터 분석도구의 결정에도 영향을 미치며 분석 후 여러 에러 사항에 대한 원인 파악에 도움을 줄 수 있습니다. 검증을 위한 샘플의 선정은 실제 패널에서 확인하고자 하는 검체의 종류와 변이의 타입을 포함해야 합니다. 

 

다음으로 검증 과정은 크게 STEP1/STEP2로 나누어 설명할 수 있는데, 각 검증 단계에서는 크게 4가지 검증 항목(정확도에 해당하는 PPA(positive percentage agreement)/PPV(positive predictive value), 정밀도에 해당하는 repeatability/reproducibility, 분석적 민감도를 확인하기 위한 LoD (limits of detection) 및 보고 가능 범위/참고 범위)을 확인할 수 있어야 합니다. 또한 위 항목들은 각각의 유전자 변이 종류에 따라 검증되어야 합니다.   

 

구체적으로 STEP1 검증은 본격적인 검증을 시작하기 전의 Optimization 단계, 즉 위 4가지 검증 항목들에 대해 최소한의 샘플로 전 과정을 미리 검증하면서 문제점을 확인하기 위한 파일럿 테스트 단계입니다. 이 과정에서 variant allele frequency (VAF) 및 minimum & mean depth of coverage에 대한 최소기준 설정이 필요합니다. 혈액암 진단을 목적으로 하는 패널에서 이들 각각에 대한 최소기준은 5%, 250 reads, 500 reads를 만족해야 합니다. 검체는 각 기관에서 패널에 해당하는 유전자 부위와 관련된 Sanger Sequencing을 실시한 양성 혈액암 환자 샘플이 가장 적합합니다. 그러나 현실적으로 샘플 수집의 한계 및 기존의 Sanger Sequencing 데이터로 NGS 패널에서의 target regions을 모두 커버하지 못한다는 한계점 등으로 인해, NA12878과 같은 표준 물질(Reference material, RM), 한 샘플에 여러 개의 양성 환자 샘플을 섞음, 또는 역시 한 샘플에 패널의 여러 유전자 부위에 일정한 VAF를 가진 다양한 변이의 종류가 포함되어 있는 Commercial Positive Control 등을 적절히 이용하여 검증에 필요한 샘플 수 및 run 수를 줄일 수 있을 것입니다. STEP1 검증과정에는 3개의 different run을 시행할 수 있는 샘플 수인 최소 20개의 샘플로 위의 검증 항목에 대해 확인하고, 기존의 검사법과 비교하여 95% 이상의 일치율을 보일 때 다음 단계인 SETP2 검증과정을 진행하게 됩니다.  

 

STEP2 검증에서는 STEP1 검증에서 확인된 각각의 기준에 대한 최소기준 만족 여부를 59개 이상의 샘플 검증과정에 적용하여 분석할 수 있습니다. 검증 전체 과정에서 정밀도를 확인하기 위해서는 변이 별로 최소 3개 이상의 샘플을 가지고 intra-run, inter-run 모두 3번 반복 측정(triplication)하고, LoD 설정에 있어서 각 변이에 따라 역시 최소 3검체 이상을 가지고 RM 등의 물질로 희석하여 여러 단계의 allele frequency(%)를 inter-run에서 triplication하여 확인해야 합니다. Commercial panel을 사용하는 경우, 해당 패널이 제시하는 분석적 특성을 확인하는 절차, 즉 verification으로 STEP2 검증과정을 생략하고, 정해진 분석적 특성들의 기준을 만족하고 기존 검사 결과와 일치율을 확인하여 해당 패널 검사를 관련 환자에게 시행할 수 있습니다. 이후 환자 검사 진행 중 검증과정(ongoing validation)이 필요한데 이는 양성 변이 환자 검체를 이용하여 대체검사로 확인검사(confirmatory test)하는 절차를 거치며 그중 일부는 proficiency test로 진행하는 것입니다.  

 

데이터 분석 파이프라인은 앞서 설명한 전체 검증과정에 포함되어 있으며, read alignment, variant calling, variant annotation and reporting, generation of quality control (QC) matrices가 이에 해당됩니다. 서로 다른 두 개 이상의 데이터 분석 파이프라인을 통해 분석을 권장하며 변이 종류에 따라 다른 분석 도구를 적용하여 비교해 볼 수 있습니다. 또한, 검사실에서는 QC metrics에 대한 최소기준을 가지고 있어야 하며, 전 검증과정에서 최소기준을 만족해야 합니다.  

 

빠르게 변화하고 있는 NGS 기술을 통하여 복잡한 검사 과정과 광범위한 제반 사항들에 대한 높은 장벽이 어느 정도 해결되고 검증과정 또한 조금 더 단순하게 바뀌지 않을까 기대합니다. 다만, NGS를 다양한 암종에 확대하여 적용하는 과정에서 생산되는 수많은 데이터들에서 발생할 변이 해석에 관련한 여러 이슈들 및 추가 확인 검사의 필요성 등에 대한 합의가 필요할 것으로 생각됩니다.

 

 

[참고문헌]

1. Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, Kamel-Reid S, Lubin IM, Pfeifer J, Temple-Smolkin RL, Voelkerding KV, Nikiforova MN. Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing-Based Oncology Panels: A Joint Consensus Recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. J Mol Diagn. 2017 May;19(3):341-365.

 

 

 

 


목록

./board/skin/newsletter/index.php