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제목 [뉴스포럼 3호] Technology Trend
작성자 관리자 작성일 2018-08-13 12:14:29 조회수 408
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차세대 염기서열 분석 기반 혈액암 패널 및 분석 소프트웨어 개발 

 

차세대 염기서열 분석(NGS) 기술의 발전 


차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, 이하 NGS) 기술이 소개된 이후 유전학을 비롯한 거의 모든 분자생물학 분야에서 활발히 사용되고 있다. 의학 분야에서도 NGS 기술을 이용해 질병을 진단하고자 하는 노력이 끊임없이 진행되어 왔으며, 2013년 미국 FDA에서 일루미나 사의 MiSeqDx를 최초의 의료용 NGS 장비로 승인한 이래로 현재는 가장 혁신적인 유전자 검사용 의료기술로 자리를 잡아가고 있다. NGS 기술은 기존의 기술과 달리 동시에 수많은 유전자를 정확하게 검사할 수 있는 탁월한 장점을 가지고 있는 대신, 수많은 유전자 마커의 유효성과 안전성을 입증하기 위한 기준 및 방법의 마련이 쉽지 않았다. 이를 위해 정부와 학계를 중심으로 NGS 검사를 위한 가이드라인을 마련하기 위한 노력이 진행되어 왔으며, 최근 NGS 검사를 위한 여러 가지 가이드라인이 마련되어 발표되고 있다.
NGS 기반의 유전자 검사는 크게 세 가지 요소로 구성된다.[1] 첫 번째 요소는 분석대상 유전자 영역만을 골라내어 NGS 장비에서 분석이 가능한 형태로 가공해주는 시약이다. [그림 1. ①~⑤] 두 번째 요소는 실제 염기서열의 해독이 진행되는 NGS 장비이다. [그림 1. ⑥] 마지막 요소는 NGS 장비로부터 생산된 디지털 데이터를 분석하여 유전변이를 찾아주는 알고리즘으로, 생물정보학 분석 파이프라인(bioinformatics pipeline)이다. [그림 1. ⑦~⑪]
  

[그림 1] NGS 기술을 이용한 유전자 검사의 흐름도 (Cottrell CE, 2014) 

 

국내에서는 2017년 3월 보건복지부 고시를 통해 NGS를 이용한 유전자 검사에 의료보험수가를 지급하기로 하였으며, 지난 한 해 동안 50여 개의 의료기관이 NGS 실시기관으로 등록하여 유전자 검사를 수행하거나 준비하고 있다. 이와 같이 NGS 기반 유전자 검사는 앞으로 지속적으로 증가할 것으로 예측된다. 

 

NGS 기반 유전자 검사 패널 및 분석 소프트웨어 개발 필요성
같은 질환이라도 개인별 유전변이 특성에 따라 약물반응성 및 질환의 진행 정도, 예후 예측 등에서 다양한 차이가 나타난다는 것이 밝혀지면서 환자 맞춤형 정밀 의료의 중요성이 증대되고 있다. 이에 따라 개인별 유전변이를 정확하게 검출하고 임상적 의의를 판단할 수 있는 높은 수준의 진단 정밀도와 변이 해석 성능의 필요성이 증가하고 있다. 또한 NGS를 기반으로 생성되는 데이터를 분석함에 있어 분석 파이프라인 구축, 발굴된 변이에 대한 해석 및 결과 리포팅은 필수적으로 요구되고 있으며 이는 질병의 진단 및 환자의 치료에 중요한 영향을 미친다. 이러한 방대한 양의 NGS 데이터를 분석하고 해석함에 있어 사용자로 인해 발생되는 오류 및 의도치 않은 실수, 검증되지 않은 분석 파이프라인의 사용은 질병의 진단 및 환자의 치료에 부정적인 결과를 초래할 수 있다.[2] 따라서 사용자의 오류를 최소화하고, 성능 또한 검증된 분석 소프트웨어의 개발이 필요하다. 

 

혈액암 진단용 NGS 패널 HEMEaccuTestTM
혈액암에서도 환자마다 다양한 변이가 존재하고, 유전자 변이 타입이 환자의 치료 효율, 약물 반응성 및 예후예측에 중요하게 작용함이 알려지고 있다.[2-5] 질환 별 유전변이의 다양한 조합 및 복잡한 형태의 변이들이 검출됨에 따라 수많은 변이를 동시에 분석할 수 있는 기술이 중요하게 여겨지고 있다. [그림 2]   


[그림 2] 혈액암 아형에 따른 변이 분포 및 약물 반응성 조사 연구

 


미국의 루카츠 와츠먼 박사의 사례를 살펴봐도 정밀의학 실현을 위해 다양한 유전체 분석기술이 필요함을 보여주고 있다. 와츠먼 박사는 2003년 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 진단을 받고 복합화학요법 치료를 받고 골수이식을 했음에도 2번의 재발을 경험하였으며 2011년 두 번째 재발 이후 치료 가능성은 매우 회의적이었다. 그러나 유전체 분석 임상시험에 참여하게 되면서 50여 개 이상의 돌연변이와 wild type FLT3 발현 증가가 확인됨으로써 신장암에서 FLT3 치료제로 시판되기 시작한 sunitinib을 복용하여 현재까지 완전 관해 상태를 유지하고 있다.[6] 당시 ALL 환자에게서는 FLT3를 검사하지 않던 상황을 고려하면 유전체 분석 시험을 통한 비예측성 변이를 확인함으로써 환자의 치료 기회가 제공된 정밀의학의 중요한 예로 평가할 수 있다.
혈액암에서의 정밀진단과 치료 효율 증대에 도움이 되고자 개발된 HEMEaccuTestTM 는 혈액암 관련 유전자 검사를 위한 NGS 패널과 분석 소프트웨어를 패키지 형태로 제공한다. [그림 3]


 

[그림 3] NGS기반의 혈액암 진단용 HEMEaccuTestTM 와 분석 소프트웨어 


급성 골수성 백혈병, 골수형성 이상, 골수 증식 종양, 악성림프종, 다발성골수종 진단에 적용할 수 있는 혈액암 관련 유전자로 구성되어 있으며, 보건복지부 고시 필수 유전자와 WHO, NCCN, ELN 등의 글로벌 가이드라인에서 권고하는 유전자, 임상의들의 자문을 통한 진단 필요 유전자를 포함하고 있어 보험수가 적용이 가능하여 환자 부담률을 낮추고 임상 활용도를 높임으로써 진단 및 치료에 도움을 줄 수 있다.[7] HEMEaccuTestTM 는 hybrid capture 방식의 NGS 패널로 amplicon 방식의 NGS 패널의 불필요한 유전자 증폭 및 증폭 과정에서 발생하는 비 특이적 변이 검출 가능성을 제한하고 정확도를 높여 진단에서의 오류를 최소화하도록 설계되었다. 특히, CEBPA, FLT3-ITD, CALR과 같은 반복 서열 및 GC content가 높아 변이 검출에 어려움을 겪는 혈액암 관련 주요 유전자는 보완과정을 통해 검출 성능을 강화하였으며, 철저한 성능검증을 거쳐 실제 임상진단에 활용하고 있다. 패키지로 제공되는 분석 소프트웨어는 혈액암에 특화된 전용 데이터베이스를 구축하고 있어 치료약물에 대한 정보뿐만 아니라 진단과 예후 예측에 관련된 근거를 제공함으로써 환자의 질환 진단과 치료 전략 구축에 도움을 줄 수 있으며 맞춤형 임상 결과지를 함께 제공하고 있다. HEMEaccuTestTM 는 현재, 국내 주요 병원 및 지역 거점병원을 중심으로 채택되어 진단에 사용되고 있으며, 이를 통해 실제 임상에서의 요구사항을 파악하고 패널 성능과 소프트웨어의 진단 유용성을 강화하고 있다. 

 

혈액암 패널을 위한 분석 소프트웨어
NGeneAnalySysTM는 NGS 장비로부터 생산된 FASTQ 파일을 업로드 후 이를 분석하고 해석하는 과정을 거쳐 최종 임상 리포트의 생성까지 하나의 소프트웨어로 가능하도록 구성되어 있다. [그림 4] 사용자는 간단히 NGS 장비와 연동된 서버의 FASTQ 파일을 선택하는 것으로 변이 해석까지의 단계를 수행할 수 있으며, 해석된 결과를 테이블 및 다양한 차트 형태로 출력이 가능하다. 돌연변이 필터 기능을 이용하여 원하는 변이를 선별하여 가공 및 출력할 수 있다. 

 

 

[그림 4] NGeneAnalySys의 단계별 사용 방법 


소프트웨어는 최대한 사용자 개입을 최소화하는 한편 직관적인 UI/UX를 통해 사용자의 의도치 않은 입력을 방지할 뿐만 아니라 사용자에 의한 변경 사항에 대한 기록을 통해 사용자 오류를 최소화하고 언제든지 변경 내역을 확인하여 오류를 추적할 수 있다. NGeneAnalySysTM는 somatic 분석에 있어서 검증된 파이프라인과 AMP(Association for Molecular Pathology)의 변이 해석 가이드라인의 근거에 따라 4개의 Tier로 변이를 구분하여 제공할 뿐만 아니라 FDA의 승인 약물이나 치료법, NCCN(National Comprehensive Cancer Network) 가이드라인을 반영하였다.[8-10] [그림 5]
 

 

 

[그림 5] NGeneAnalySys의 분석 결과 화면 


데이터 품질검사(QC) 리포트는 분석이 진행되면서 자동으로 생성되며, 사용자는 각각의 QC 항목에 대한 값 및 결과가 기준에 부합하는지 확인할 수 있다. 소프트웨어에 의해 자동으로 분류된 변이를 판독 전문가가 선별하여 임상적 의미와 중요도가 포함되도록 임상 리포트를 구성한다. 사용자에 의해 임상 리포트의 수정이 가능하며, PDF를 포함한 다양한 형태로 출력이 가능하다.
 

 

[참고문헌]
1. Validation of a Next-Generation Sequencing Assay for Clinical Molecular Oncology. J Molecular Diagnosis. 2014; 16:89-105
2. Type of blood cancers – and the new molecular diagnostics. https://www.mlo-online.com/types-of-blood-cancersand-the-new-molecular-diagnostics.php. Accessed by. August 17, 2013.
3. Introduction to Genomics in Hematologic Malignancy. J Clin Oncol. 2017 Mar 20; 35(9): 927-928.
4. Diagnosis and classification of hematologic malignancies on the basis of genetics. Blood. 2017; 130(4): 410-423
5. Genomic classification and prognosis in Acute Myeloid Leukemia. N Engl J Med. 2016; 374(23): 2209-2221.
6. A case of me: clinical cancer sequencing and the future of precision medicine. Cold Spring Harb Mol Case Stud. 2015; 1(1).
7. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20): 2375–2390.
8. Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipelines. The Journal of Molecular Diagnostics. 2018; 20(1), 4–27.
9. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. 2015; 1–20.
10. Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer. The Journal of Molecular Diagnostics. 2017; 19(1), 4–23. 

 

 

 

 

 

혈액암 진단용 NGS 패널 HEMEaccuTestTM 와 분석 소프트웨어 NGeneAnalySysTM 의 사용 경험 

이준형 (화순전남대학교병원) 

도입배경
2015년 1월 미국 오바마 대통령의 Precision Medicine Initiative로 시작된 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing, NGS) 검사의 바람이 우리나라로 불어 닥치는 데는 다행히도 그리 오랜 시간이 걸리지 않았다. 2017년 1월 말 보건복지부의 ‘차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 유전자 패널 검사의 급여 적용’ (보건복지부 고시 제2017-15호) 발표로 우리 임상검사실에서도 NGS의 시대가 활짝 열리게 되었다. 본 저자는 이 기고에서 혈액암 센터를 운영 중인 대학병원에서 세팅한 NGS 검사 패널과 분석 소프트웨어의 사용 경험을 설명하고자 한다.
 

 

고려사항
혈액암을 대상으로 한 NGS 검사를 준비하며 고민했던 문제는 크게 2가지이다. 첫 번째, 검사를 잘 수행할 수 있을 것인가? 즉, 100개가 넘는 많은 수의 대상 유전자들을 한 번의 검사로 잘 커버할 수 있을까였는데, 이전에 접했던 여러 종류의 연구용 검사들에서 일정하지 못한 coverage 때문에 상당한 우려를 갖고 있었다. 두 번째는 검사 결과를 잘 보고할 수 있을 것인가였는데, germline에 비해 변이형 빈도(variant allele frequency)가 훨씬 낮아 수없이 많이 쏟아져 나올 변이들 중 어떻게 위양성 결과를 잘 걸러내고 중요도를 구분해서 보고할 것인가 하는 고민이었다.
 

 

NGS 패널 도입 시 성능평가
NGeneBio의 HEMEaccuTest 도입 시 시행한 성능평가 중 가장 중요한 coverage 분석은 핵형 검사에서 정상 핵형을 확인한 정상인 DNA를 이용하여 3회 반복 수행하였다. 이때 단순 depth of coverage는 동시에 검사하는 검체 수와 reagent kit의 용량에 따라 그 결과가 달라지기 때문에, 객관적인 분석을 위해 해당 검사 결과의 평균 depth를 기준으로 분석하는 coverage uniformity를 평가하였다. 3회의 반복 측정(triplication) 결과 target region의 99% 이상이 0.1×mean depth 이상을 만족했으며, 98% 이상에서 0.2×mean depth를 만족했다. 특히 검사실의 검사 담당자가 HEMEaccuTest의 검사방법에 익숙해지고, 부대장비들이 안정화된 3회 차의 run에서는 target region의 99.9%에서 0.1×mean depth를, 99.3%에서 0.2×mean depth를 만족했다. 즉, 평균 depth가 1000x 였다면, target region의 99.9%에서 100x 이상, target region의 99.3%에서 200x 이상의 안정적인 coverage를 보여주어 coverage에 대한 초기의 우려를 불식시켜 주었다.
 

 

 

[그림 1] 검사 도입 시 시행한 Coverage Uniformity 평가 결과 (3회의 반복 측정 결과) 

 

정확도 및 검출한계 평가는 somatic variant의 commercial reference standard인 Tru-Q1 (5% Tier, HD728; Horizon, USA)을 이용하였다. Tru-Q1과 정상인 DNA를 5단계로 희석한 검체를 반복 측정하였는데, 결과는 표 1 과 같다. HEMEaccuTest는 Tru-Q1의 insert paper 상의 11가지 변이를 빠짐없이 검출하였고, 추정된 최소 검출한계는 0.8%였다 (반복 측정 횟수의 제한으로 통계적으로 엄밀한 검출한계 평가는 아님). 

 

 

[표 1] 검사 도입 시 시행한 정확도 및 검출한계 평가 결과 

 

검사 운영
2018년 7월 말까지 약 100여 개의 혈액암 검체에 대해 HEMEaccuTest를 이용하여 임상검사를 진행하였으며 검사 도입 초기를 제외하고는 별도의 재검 없이 안정적으로 검사를 운용하고 있다. NGS 검사 도입 시 우려했던 somatic variant의 많은 위양성 문제는 GATK4의 Mutect2를 이용하여 해결하였는데, 현재 1차 개발이 마무리되고 최종 기능 개선 단계에 있는 NGeneAnaySys도 variant caller로 GATK4의 Mutect2를 지원하고 있다. 따라서 검출된 somatic variant 중 위양성 변이를 걸러낼 수 있는 다양한 필터링 옵션(read position error, strand bias, str contraction 등)을 제공하여 간단한 클릭 몇 번으로 위양성 변이를 대부분 배제할 수 있게 되었다. 또한 FDA approved drug 등 검출된 변이의 중요도 평가를 위한 다양한 데이터베이스를 갖추고 있어, 이들 임상정보를 최종 검사보고서에 쉽게 추가할 수 있도록 지원함으로써 Tier System 분류 과정이 매우 신속하고 간편화 되었다. 향후 NGeneAnalySys를 이용한다면 보고서 작성을 상당부분 자동화할 수 있게 되어 담당 전문의의 업무 부담을 크게 줄여주고 검사 소요시간(TAT) 중 보고서 작성에 소요되는 시간을 획기적으로 줄여줄 것으로 기대된다.

 

 


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