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제목 [뉴스포럼 4호] Focus on
작성자 관리자 작성일 2018-11-23 13:05:18 조회수 543
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Droplet digital PCR 검사 장비 운용 경험
최종문 (녹십자의료재단 진단검사의학과)

일반적으로 PCR 검사는 증폭 산물의 존재 여부와 그 양을 측정할 경우 Gel, Capillary와 같은 media를 통해 전기 영동 (Electrophoresis)을 하거나, 형광 dye에 tagging하고 PCR 반응에 따른 형광의 변화를 측정합니다. 일반 PCR 검사의 경우 한 tube 내에서 template와 primer, enzyme 등을 서로 섞인 상태에서 반응이 일어납니다. Digital PCR은 이와 달리 PCR mixture를 oil droplet (Droplet digital PCR, ddPCR)이나 microfluidic chip (Chamber digital PCR, cdPCR)등을 이용해 여러 개의 분리된 공간으로 나누고 이들의 반응 정도를 각각 측정합니다. [그림 1]


[그림 1] 일반 PCR과 ddPCR (Droplet digital PCR)의 차이

다른 물질에 비해 상대적으로 저농도로 존재하는 template는 격리된 공간 내에 0개 혹은 1개만 들어가게 되고 template가 존재하는 droplet만 반응이 일어납니다. 이를 통계학적 기법을 통해 계산하면 template의 절대량을 높은 정확도로 추정할 수 있습니다. Digital PCR은 표준 곡선 없이도 절대 정량이 가능하며 민감도가 높아 Liquid biopsy, Copy number detection, expression quantification, single cell analysis, 미생물의 검출이나 NGS Library의 정량 등 다양한 방면에서 활용 가능합니다.

저희 검사실에서는 이러한 digital PCR의 장점을 살려 NGS 검사를 통해 나온 유전자의 copy number change를 ddPCR로 확인하고자 실험을 진행했습니다. Whole exome sequencing이나 Panel sequencing으로 large deletion/duplication을 검출하는 것은 상당히 도전적인 과제입니다. ExomeDepth나 VisCap과 같은 copy number 변화를 검출하는데 유용한 Bio-informatics tool들이 공개되어 있으나, NGS library prep 과정에서 생기는 여러 가지 변수에 의해 false positive가 발생할 수 있습니다. 이에 대해 확인할 추가적인 검사로 여러 가지 검사법이 검토되었으나, 기존의 Multiplex ligation-dependent probe amplification이나 Chromosomal microarray analysis와 같은 copy number change를 확인하는 검사법들은 비싸고 검출하고자 하는 위치에 따라 확인이 불가능한 경우도 존재합니다. Real-time PCR이나 capillary electrophoresis를 이용한 Fragment analysis로도 exon copy number를 추정하는 것이 가능하나, 검사 정확성이 다소 낮고 대부분의 경우 검사 세팅에 많은 시행착오가 수반됩니다. 검출하고자 하는 CNV가 특정 유전자에만 고정되어 있다면 큰 문제가 되지 않지만 보고자 하는 유전자가 다양하다면 기존 플랫폼만으로는 단시간 내에 목표를 이루는 것이 어렵다고 판단했습니다. 이에 비해 ddPCR, 특히 intercalation dye를 이용한 ddPCR의 경우, primer dye tagging이 필요 없어, 검사 비용을 절약하고 primer 제작에 걸리는 시간도 2~3일로 단축되어 신속한 결과 판정에 많은 도움이 될 수 있을 거라고 생각했습니다.

결론을 먼저 말씀드리면 검사 정확성이 높고, 빠르게 세팅할 수 있다는 점에서는 만족스러웠으나일반 PCR 검사에 비해 변수가 많았고, robust한 결과를 얻기 위해서는 많은 시행착오가 필요할 수 있음을 느꼈습니다. ddPCR을 활용함에 있어서 주로 문제가 됐던 점은 비특이적 증폭과 droplet rain 문제였습니다.

비특이적인 증폭은 Primer가 제대로 설계되지 않거나 PCR 조건의 최적화되지 않은 경우 흔히 발생합니다. 이는 digital PCR만의 자체 문제라기보다는 PCR을 이용한 검사의 공통적인 문제라 볼 수 있으나 이를 확인할 수단이 ddPCR은 제한되어 있어 겔 전기 영동 등 추가 검사가 필요할 수 있습니다. 또 다른 주요 문제인 Droplet rain은 oil droplets이 물리적 요인으로 인해 깨지면서 발생하는 현상입니다. [그림 2] 


[그림 2] A, B, D의 경우 정상적으로 데이터가 생산되었으나, C 열의 데이터는 droplet의 cluster 형성이 불량하고 흘러내리는 듯한 양상의 “Droplet rain”을 보이는 것을 알 수 있습니다.
Droplet rain이 발생하면 PCR 양성 droplet(파란색)을 제대로 읽지 못해 실제보다 농도가 낮게 측정됩니다.

제조사에서는 이러한 문제가 대부분 droplet을 파이펫으로 옮기는 과정에서 발생하므로, 파이펫팅 시 그 속도와 각도에 주의하고, 가급적 전동 파이펫을 사용할 것을 권장합니다. 실제 실험자의 경험이 쌓이고 실험 프로세스를 개선하는 과정에서 검사의 정밀도가 증가하는 양상을 보였으나 [그림 3] 실험 오류를 100% 차단하는 것은 불가능했으며 모든 test를 duplication을 통해 이를 확인하는 것이 필수적이었습니다. Duplication 과정에서 발생하는 시간 및 시약의 낭비를 고려할 때 droplet rain의 정도를 측정할 수 있는 지표와 threshold의 설정이 필요하다고 생각됩니다.



[그림 3] 검사 일자 별 ddPCR 정량 값의 CV값 변화에 대한 box plot. 평균 CV값은 검사가 안정화되어 가면서 점차 감소했으나 9월 30일 일부 실험에서 droplet rain이 발생하여 max CV(흰색)가 올라간 양상을 보입니다.

현재로서는 ddPCR을 기존 검사법인 Real-time PCR을 대체한다기보다는 보완하는 용도로 사용하는 것이 검사 효율성에서 나을 것으로 판단됩니다. Real-time PCR의 정량 과정은 표준 곡선 문제가 해결되면 그 이후 과정은 Digital PCR보다 검사 단계가 단순하며 PCR contamination의 가능성도 크지 않다는 장점이 있습니다. 만약 상품화된 검사 키트가 있거나, 동일한 primer를 이용하여 많은 수의 검체를 정량하는 경우 real-time PCR이 ddPCR보다 나은 선택일 것입니다. 하지만 liquid biopsy, microbiome, single cell PCR 등 새로운 검사법이 점차 임상 영역에 들어오고 있고 이러한 검사들이 필요로 하는 검사 정확성의 수준을 기존 real-time PCR만으로는 기대하기 어려우므로, digital PCR의 검사 정확성, 편의성 부분이 현재보다 개선된다면 향후에는 ddPCR만의 확고한 위치를 가질 수 있을 것이라고 생각합니다.



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