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제목 [뉴스포럼 4호] Technology Trend
작성자 관리자 작성일 2018-11-23 13:47:02 조회수 229
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광범위 유전질환 NGS 패널의 임상 적용
Targeted Panel Sequencing, Illumina TruSight One Panel

Next-generation sequencing 유전자 패널 검사 
차세대염기서열분석(Next-generation sequencing, NGS)은 대용량 병렬형 염기서열분석으로 하나의 유전체를 다수의 절편으로 분해하여 각 절편의 염기서열을 동시에 읽어내어 얻어진 유전체 데이터를 생물정보학적 기법으로 통합분석하는유전자 검사기술이다. NGS 유전자 패널 검사는 2017년 보건복지부 고시에 따라 시작되어 2018년 10월 기준 52개 병원으로 확장되었다. 국가에서는 2014년부터 희귀질환 진단지원사업을 시행하여 NGS를 이용한 유전성 질환 검사를 지원해왔다.[1] 
유전성 질환은 동일 유전적 결함을 기진 사람에서도 표현도(expressivity)가 다르고 침투율(penetrance)이 불완전하여 임상증상이 다양하게 나타난다. 표현도는 동일한 유전질환에 이환된 개인 간 유형 및 중증도 등 임상상의 변이가 존재하며, 동일 가족 구성원에서도 다양한 표현도를 보일 수 있다. 침투율은 특정 질환을 유발하는 돌연변이를 가진 사람 중에서 실제 임상증상을 보이는 사람의 분율로 발병 연령이 늦거나 표현도(expressivity)가 다양한 질환의 경우일수록 낮은 침투도를 보일 수 있다. 또한 allelic heterogeneity, locus heterogeneity 외에도 원인유전자의 발현에 영향을 주는 다른 유전자(modifying genes)의 존재, 환경 요인 등의 상호작용에 의해 더욱 다양한 표현형이 나타날 수 있다.
유전형을 기반으로 내린 진단이 표현형과 일치하는 것조차 기대하기 어려운 상황에서 표현형으로 유전형을 유추해 내는 어려움은 더할 수밖에 없다. 따라서 ‘어떤 유전자를 선정하여 검사를 처방할 것인가?’라는 결정을 주치의가 하게 된다.

Whole Exome Sequencing VS Targeted Panel Sequencing
NGS 유전자 검사로 동시에 검사할 수 있는 유전자 개수는 계속 늘고 있지만 그와 더불어 질환과 연관된 유전자를 선정하고 패널을 구성하는 어려움도 늘고 있다. 
Whole exome sequencing(WES)은 단백질을 코딩하는 인간 유전체의 2%를 차지하며 유전질환을 유발하는 원인 유전자 돌연변이의 85%가 위치한 엑솜(exome)을 분석하는 NGS 검사이다. 주로 유전질환에 기여하는 새로운 원인 유전자를 발굴하기 위해 사용하며 비교적 높은 검사비용과 고난도의 생물정보학적 분석기법이 요구된다. 그러나 다양한 원인 유전자의 돌연변이에 의한 복합 유전질환의 경우 환자의 임상증상을 근거로 Resequencing 검사를 시행하는 것이 비용과 효율 면에서 유용하게 사용될 수 있다. Resequencing은 이미 기준염기서열이 완성된 전장 유전체를 기준으로 환자의 염기서열을 비교 분석하는 검사기술로 유전형-표현형이 규명된 유전질환의 경우 특정 원인 유전자를 선택적으로 선별하여 비교 분석하는 Targeted panel sequencing이 활용된다. 대표적인 WES과 Targeted panel sequencing의 임상적  유용성을 평가하는 연구는 에스토니아의 타르투 대학병원에서 수행되었는데 WES의 진단율은 28%(18/65), 광범위 유전질환 NGS 패널의 진단율은 26%(132/501)이었다. 이는 질환별로 선별되지 않은 환자의 검사 결과로 광범위 유전질환 NGS 패널과 WES 간의 진단율이 차이가 크지 않다는 것을 보여주었다.[2]

4318개의 Targeted Panel Sequencing – Illumina TruSight One 패널
에스토니아 논문 연구에서 사용된 대용량 유전자 패널은 Illumina사의 TruSight One 패널로 멘델 유전질환과 관련된 유전자에 대한 상용화된 임상용 엑솜시퀀싱(Clinical exome sequencing)이다. 보통 Targeted Panel Sequencing 검사에 사용되는 유전자 수가 300개 내외인 반면 TruSight One패널은 유전질환의 원인 유전자 4,813개가 포함된 62,000개의 엑솜을 빠르고 효율적으로 분석할 수 있다. 
TruSight One 패널은 Human Gene Mutation Database(HGMD)와 the Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM) 자료에서 유전질환 관련 유전자를 추출하고 GeneTests.org를 참고하여 부족한 유전질환 관련 유전자를 추가하였다. 이를 통해 제작된 TruSight One 패널의 크기는 12 Mb이다. 이와 같은 광범위 NGS 패널을 운영하면 결과적으로는 환자의 진단에 소요되는 비용과 노력을 감소시킬 수 있다. 따라서 TruSight One Panel은 Whole Genome Sequencing이나 WES에 비하여 임상 검사실에서 빠르고 효율적으로 NGS 분석을 수행할 수 있는 검사로 사용될 수 있다.

 

 

 

 



[Figure 1] TruSight One Series Global Gene Content Contributors. The TruSight One Panels focus on exonic regions of the genome with known disease-associated mutations.

 

 

 

 


[Figure 2] Illumina targeted gene sequencing panel TruSight One 패널 소개3

TruSight One Panel 검사 방법
NGS 유전자 패널 검사는 인체 유래물에서 추출한 50 ng의 핵산을 이용하여 라이브러리를 제작하는 전처리 과정과 NGS 장비에서 염기서열분석을 진행하는 과정으로 나뉜다. TruSight One 패널은 Hybridization Enrichment 방식을 택하고 있다. 세부적으로는 핵산을 분절화시키는 단계(Tagmentation)와 PCR 증폭 단계, 혼성화 단계, PCR 산물 클린업 단계로 나눠지며 이틀간 실험이 진행된다.

 




 

 



[Figure 3] TruSight One Workflow—The Illumina TruSight One Workflow provides a solution for every step from library preparation to data analysis and data reporting.

장비는 Illumina Miseq Dx 와 NextSeq 550Dx를 사용할 수 있는데 MiSeq Dx 장비는 한번에 3 검체를 실험할 수 있고, NextSeq 550Dx 장비는 12검체를 동시에 진행할 수 있다. NextSeq 550Dx 장비도 최근 체외진단 의료기기로 허가를 받았으며 검사 처리 용량이 커서 Whole Exome Sequencing이나 Whole Genome Sequencing 이 가능하다. 결과는 Illumina에서 제공하는 BaseSpace Sequence Hub 분석 파이프라인을 통해 유전자 내 염기서열의 변이를 찾을 수 있으며 정도관리 보고서와 변이 정보가 생성된다. 질병 연관성과 표현형, 인종별 SNP 비율과 같은 정보는 Illumina VariantStudio 및 Base space variant interpreter (BSVI) 소프트웨어를 이용하여 분석하고 판독 보고서 작성이 가능하다. BSVI는 ACMG 가이드라인에 따라 변이 분류 정보를 제공하며 환자의 유전자형-표현형의 연관성을 논문 database와 연계할 수 있으며 누적된 판독 자료를 내부 정도관리에 이용할 수 있다.[3] [Figure 4]

 

 

 

 


[Figure 4] Illumina Variant Interpreter[2차 분석 소프트웨어(BI)] 구동 화면


[참고문헌]
[1] 2017년도 진단지원사업 실적보고서 (박성섭. 서울대학교 병원, 2017)
[2] Large gene panel sequencing in clinical diagnostics-results from 501 consecutive cases, Clin Genet 2018;98:78-83
[3] TruSight™ One Series of Sequencing Panels Data Sheet, Pub. No. 670-2013-015-C QB #4728
[4] Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 2015;17:405-424.




Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사 사용경험
박준홍 / 김명신 (가톨릭대학교 진단검사의학교실)

도입배경
정밀의료(precision medicine)는 유전자, 환경, 생활습관 등 환자 개인의 가변성을 고려해 효과성을 극대화할 수 있는 질병 치료 및 예방 방법을 의미한다. 우리나라에서도 보건복지부에서 차세대염기서열분석(Next-Generation Sequencing, NGS)기반 유전자 패널검사를 고시하여 2017년 3월부터 유전성 유전자검사의 경우 질환별로 1회 인정하여 급여검사(본인부담 50%)로 시행할 수 있게 되었다. 본 기고에서는 가톨릭유전진단검사센터와 가톨릭선천성질환센터를 운영 중인 상급의료기관에서 Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사 사용경험에 대해 공유하고자 한다.

고려사항
우리나라에서는 희귀질환을 유병률이 2만 명 미만으로, 인구 10만명 당 42.5명 이내의 유병질환으로 적절한 치료방법과 치료의약품이 개발되지 않은 질환으로 정의하고 있으며 세계보건기구에 의하면 약 7,000여 종이 넘는 것으로 알려져 있다. 희귀질환별 유전자 패널 구성은 현재까지 관련 연구를 근거로 표현형-유전형 상관성이 규명된 유전자만을 선별적으로 선정하는 것이 매우 중요하다. 또한 각 검사실에서 자체 제작한 유전자 패널 검사를 시행할 경우, 패널의 검사 수행능력과 유효성 검증 등의 검사의 유효성을 실제 검사 시행 전에 반드시 평가해야만 한다. 그러나 자체 제작 유전자 패널 검사를 완벽히 검증할 수 있는 표준화된 검증물질이나 정도관리물질이 없으며 특정 희귀질환에 대한 검증용 환자 검체도 확보가 어려울 실정이다. 특히 원인 유전자가 다양한 복합유전질환의 경우 개별 패널검사를 각 검사실에서 모두 구비하는 것은 현실적으로 불가능하므로 1회 시행으로 다수의 유전질환을 진단할 수 있는 범용 유전자 패널검사를 시행하는 것이 현실적으로 도움이 될 수 있다. 이러한 측면에서 Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사는 유전성 희귀질환 관련 4,813개 유전자의 돌연변이 여부를 1회 검사로 확인할 수 있는 매우 높은 결과 생산성을 보이는 상용화된 차세대 염기서열 분석검사이다. 유전질환 패널검사로 선정된 세부 유전자 항목은 제조사 홈페이지에서 제공하고 있다(http://emea.support.illumina.com/downloads.html). 

패널검사 도입 시 유효성 검증
Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사는 기본적으로 Germline mutation을 검출하는 측면에서 allele burden(정량, %) 이 아닌 zygosity에 따라 heterozygous/homozygous 를 구분하는 것이 중요하므로 10x, 20x, 30x 에서 depth of coverage를 95%, 90%, 85% 이상으로 기대하고 yield on target과 mean depth(x)를 산출하여 mapping data의 질을 평가하였다. 또한 의심되는 유전자 돌연변이의 read depth (<30x) 가 낮거나 환자의 임상증상에 관여하는 것으로 판단되는 경우 Sanger sequencing을 기준검사법으로 채택하여 돌연변이 유무를 재확인하였다. NGS 도입 전 가톨릭유전진단검사센터에서 Sanger sequencing으로 진단한 16종의 다양한 단일유전질환과 복합유전질환(유전성 난청, 유전성 대동맥질환, 선천성 면역 결핍증, 적혈구 효소결핍증, 판코니빈혈 등) 환자의 DNA를 이용하여 정확도 검증을 무작위 맹검법으로 분석한 결과 기존 Sanger sequencing 결과와 모두 일치하였다. 

검사운영
서울성모병원에서는 NextSeq 장비를 이용하여 Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사를 위해 환자말초혈액에서 추출한 50 ng DNA를 대상으로 12개의 검체를 동시에 1회 검사로 시행하고 있다. 주요 패널검사는 임상의사들의 관심이 높은 유전성 난청, 유전성 대동맥질환, 선천성 면역결핍증과 관련된 유전자 항목을 아분류하여 시행하고 있으며 또한 타 상급의료기관에 비해 혈액질환/혈액암 환자의 분포가 높아 선천성 백혈구 감소증, 선천성 혈소판 감소증, 유전성 용혈성 빈혈, 판코니빈혈, 골수부전증후군 등의 선천성 혈액질환에 대한 유전자 패널을 세분화하여 검사의 분석 정확도를 높이고 있다. 기본적으로 read depth 의 95%가 10X 이상임을 확인하고 Exome sequencing 후 생산된 FASTQ 파일은 Illumina VariantStudio, BaseSpace Variant Interpreter 등의 클라우드 기반 분석 소프트웨어를 이용하여 NGS 데이터 분석 및 결과 보고가 가능하다. 해당 프로그램에서는 Germline mutation과 Somatic mutation 등 쉽게 분석할 수 있는 다양한 분석 옵션을 원하는 생물정보분석에 따라 선택하고 수정할 수 있는 장점이 있다. 또한 단일 생물정보분석 파이프라인만을 사용하여 발생하는 분석 오류를 방지하기 위해 리눅스 기반의 생물정보분석 파이프라인을 구축하여 2차 분석을 시행하고 있다. 2차 분석 시, 서로 다른 2인 이상의 진단검사의학 전문의가 dbNSFP 프로그램을 이용하여 검출된 변이의 HGVS 명명, 변이의 위치, 변이의 종류, 변이의 zygosity, 변이의 depth, 변이의 공공 시퀀스 데이터베이스별 빈도, 관련 임상증상(OMIM, Clinvar 등), 병적 예측, 보존성 평가 등이 정리된 TSV 파일을 맹검분석하여 분석결과를 토의와 문헌고찰 후 결과통보하고 있다.
결론적으로 Illumina TruSight One 희귀유전질환 패널검사는 Whole Genome Sequencing (WGS) 또는 Whole Exome Sequencing (WES)과 비교하여 상대적으로 저렴한 검사비용과 신속한 검사소요시간으로 효율적으로 희귀유전질환 관련 유전자에 대한 exome sequencing을 수행할 수 있는 매우 우수한 NGS 검사로 평가할 수 있다.

 


[Fig 1] BaseSpace Variant Interpreter 프로그램을 이용한 Trio 분석 결과로 윌슨병 환자의 ATP7B 돌연변이 규명(다우바이오메디카 제공)


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