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제목 [뉴스포럼 5호] Technology Trend
작성자 관리자 작성일 2019-03-05 11:58:52 조회수 128
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LymphoTrack IgH Array Kit를 활용한 혈액암 환자의 MRD monitoring 과 Somatic Hypermutation 효용성

Clonality Test 원리
다른 체세포와 달리, 림프구는 발달 중 Antigen receptor 유전자의 체성 유전자 재배열(Somatic gene rearrangement)을 겪게 된다. B-림프구는 14번 염색체(14q32.4) 위에 면역글로불린 중쇄(Immunoglobulin Heavy Chain, IgH) 유전자에서 체성 유전자 재배열이 일어나며, 46-52 종류의 Variable (VH) gene segments와 27 종류의 Diversity (DH) gene segments, 6 종류의 Joining (JH) gene segments 중에서 선택된 Segment들간의 조합은 VH-DH-JH와 같이 연결된 고유한 염기서열을 생성한다. IgH 전체 유전자 길이는 1250 Kbp를 넘어서지만 재배열이 진행되면서 선택되지 않은 Segment와 Intron이 제거되며, 조합이 완성된 DNA 가닥은 1 Kbp 보다 작게 된다. 체성 유전자 재배열 단계를 경험한 림프구는 다른 체세포의 ‘Germline antigen receptor 유전자’와 확연히 구분되는 ‘재배열된 Antigen receptor 유전자’를 갖게 되는 것이다. 




[Fig. 1] IgH gene rearrangement 모식도[1]

IgH 유전자 내부의 각 VH gene segment 부위는 잘 보존된 3개의 Framework Region(FR)과 변이가 잦은 2개의 Complementarity-Determining Region(CDR)로 구성되어 있다. CDR3은 VH-DH-JH 조합 부위에 존재하며, 재배열 과정 중 Non-template sequence가 VH-DH 사이와 DH-JH 사이에 삽입되면서 변이 비율이 높아지게 된다. Non-template sequence는 무작위적인 우연의 산물로써, 해당 부위의 길이와 염기서열은 서로 다른 유래의 림프구끼리 동일할 수 없으며 다형성의 근본이 된다. 

혈액암은 개별적인 림프구가 암세포 또는 그와 유사한 세포로 형질 전환 과정을 시작으로 혈액 내 무한 증식하는 질환이므로, 모든 혈액 종양 세포들은 하나 이상의 특이적인 Clonal antigen receptor gene rearrangement를 공유하게 된다. 그러므로, IgH clonal rearrangement를 탐지하는 검사 방법은 혈액암 진단에 유용하다.

IgH Clonal Rearrangement 검사 – LymphoTrack
LymphoTrack 제품은 Antigen receptor 유전자의 잘 보존된 Framework Region(FR)에 상보적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머에 의한 PCR 증폭 과정으로 라이브러리를 제작한다. Forward primer는 VH gene segment 내 3개의 Framework (FR1, FR2 or FR3) 중 하나와 결합하고, Reverse primer는 JH gene segment 내 FR4에 결합한다. 프라이머는 타켓 영역(VH and JH)에 결합하는 염기서열 외에도 5‘-overhang으로 연결된 부가적인 염기서열을 갖고 있다. 일루미나 NGS 장비(i.e. MiSeqDx) 구동에 필수적인 Adapter와 Index가 해당된다. Adapter 부위의 염기서열은 일루미나 NGS 장비 안에서 클러스터 생성과 염기서열분석 단계마다 프라이머가 결합하는 영역을 제공하며, Index 부위의 염기서열은 검체 식별 기호로 사용된다. 그러므로 LymphoTrack 제품은 포함된 프라이머를 사용한 단 한 번의 PCR 단계로 일루미나 NGS 장비에 탑재 가능한 형태의 증폭산물(라이브러리)을 제작하게 구성되어있다.

기존 IdentiClone 검사법과의 차이점
LymphoTrack 제품의 출시 이전부터 동일 제조사의 IdentiClone 제품은 Clonality test 목적으로 의료 시약으로 사용하고 있었으며, 진단검사의학과 검사실에서는 PCR 산물의 절편 길이를 ABI Genetic Analyzer (-3130, -3500, -3730) 장비로 1~3 bp 해상도로 분석하는 Genescan 검사법을 활용하고 있다.
정상인의 IgH Clonal gene rearrangement가 완료된 또는 진행 중인 림프구 집단에서는 조합된 DNA 가닥의 CDR3 영역에서 길이의 다형성이 관측되며, 이는 Gaussian Curve(또는 정규분포 곡선) 양상으로 판독된다. 이에 반해, 혈액암 또는 림프구증식질환을 보유한 환자의 림프구 집단에서는 동일 세포 유래의 클론들이 공유하는 Clonal gene rearrangement 결과에 따라 1~2개의 재조합된 DNA 길이가 우세하게 관측된다. 



[Fig. 2] 림프구증식질환에 동반된 CDR3 영역의 Polymorphism과 Genescan 검사 결과[2]

문제는 Genescan 검사법은 전체 림프구 집단에 존재하는 조합 DNA를 주형으로 PCR 증폭하기 때문에 발생한다. 종양 세포들은 클론 세포들로써 동일한 IgH gene rearrangement 결과를 공유하더라도 다른 정상적인 림프구들이 우세한 경우에는 Genescan 검사 결과에서 Monoclonal 양상이 Polyclonal background에 가려져서 관측되지 않을 수 있다. IdentiClone 양성 판독은 Genescan 검사결과에서 Polyclonal background 높이 대비 우세한 Peak 높이가 3배 이상을 기준으로 한다. 이로 인해 IdentiClone 제품을 활용한 Clonality test의 민감도는 5%를 한계로 보아야 한다. [Fig. 3 우]

5% 민감도는 일반적인 초진 검체에서는 문제가 되지 않지만 낮은 민감도를 극복하기 위한 대안으로 LymphoTrack 제품을 고려할 수 있다. LymphoTrack 제품은 IdentiClone과 동일한 프라이머 세트로 PCR 증폭 후 라이브러리 제작 과정을 통해 차세대염기서열분석(NGS) 장비에 구동시키는 방식으로, 개별 DNA 가닥 별로 염기서열 분석을 진행하여 동일한 길이와 염기서열끼리 그룹을 형성하는 방법으로 진행된다. 그로 인해 Polyclonal background에 가려지는 문제가 발생되지 않아서 혈액 종양 세포의 비율이 낮은 검체에서도 사용할 수 있으며, 민감도는 NGS 분석을 위해 배정한 ‘Depth of coverage’가 몇 가닥(단위: Reads)인지에 따라 결정된다. [Fig. 3 좌]



[Fig. 3] LymphoTrack(좌)와 IdentiClone(우) 민감도 비교[3]


Lymphotrack 검사의 활용
1. Minimal Residual Disease
MRD 측정을 위한 민감도는 0.01~0.001%이며, NGS을 활용한 Ultra deep sequenicng으로 도달할 수 있는 수준이다. LymphoTrack 제조사 자료에 의하면 양성대조물질을 음성대조물질로 단계적으로 희석하는 방법으로 Limit of Detection(LOD)가 0.0001%(10-6)까지 측정되었다. (상관계수, R2=0.9977)




[Fig. 4] Minimal Residual Disease의 민감도(좌)와 LymphoTrack 직선성(LOD) 평가 결과(우)[3]


2. Somatic Hypermutation
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)과 Small Lymphocytic Lymphoma (SLL) 환자의 예후와 IgH 유전자 VH 부위에 발생하는 Hypermutation 정도의 연관성이 연구되었다. Somatic Hypermutation(SHM)의 유의미한 수준은 Germline VH 유전자의 염기서열 대비 2% 이상의 변이가 존재하는 경우를 의미한다. 특히 B cell-CLL에서 임상적 타당성이 분명히 나타나며, SHM를 갖는 환자는 좋은 예후를 보인 반면에 부재 시에는 나쁜 예후로 진행됨이 보고되었다.4)
SHM의 수준을 정확히 측정하기 위해서는 재배열된 IgH 유전자를 가능한 넓게 염기서열 분석을 진행하여야 한다. LymphoTrack은 분석 소프트웨어 결과 중 ‘V-Coverage(%)’ [Fig. 5] 항목을 지표로 관측값과 실제값의 상관관계를 예상할 수 있다.
LymphoTrack 제품군 중에는 SHM 전용으로 개발된 Kit가 존재하며, Lead-primer와 JH-primer를 프라이머 쌍으로 사용한 PCR 증폭 산물은 조합된 VH-JH-DH 영역을 거의 전부 대상화하고 있다. 하지만 제조사 자료를 기반으로, IgH FR1부터 J 영역까지를 대상으로 검사를 진행하는 것으로도 충분히 대체가 가능하다. [Fig. 5]



[Fig. 5] IgH FR1-primer와 Lead-primer somatic hypermutation 일치도[3]


LymphoTrack 검사 사용 방법
염기서열과 길이를 기준으로 unique read 단위로 표시하는 방법과 1~2개의 Mismatch를 동일한 DNA 가닥으로 반영한 merge group 방식으로 분석할 수 있다. “V-gene” 열과 “J-gene” 열을 통해 재배열된 선택된 Gene segment 종류를 확인할 수 있으며, “Mutation rate to partial V-gene(%)” 열은 Somatic hypermutation 수준(> 2.0%)과 대비하여 판독 가능하다. “In-frame”은 재배열 과정 중 Indel 발생 가능성에 따라 Frameshift 가능성과 SNV에 의한 Stop codon으로 아미노산 수준의 변이가 발생할 가능성도 확인할 수 있다. [Fig. 6 위]

판독 기준은 검체당 총 염기서열 가닥 수가 5만 개 이상이 확보가 되어야 하며, 전체 염기서열 중 차지하는 비율이 2.5% 이상의 가닥이 1~2개인 조건과 전제 조건을 통과한 가닥의 비율이 4번  째 빈도 순위의 가닥의 비율 대비 5배 이상이어야 하는 조건을 동시에 충족하여야 한다. [Fig. 6 아래]




[Fig. 6] LymphoTrack Merge 분석 결과표와 SHM 분석값(Red Parenthese)(위)와 양성 판독 기준(아래)[3]

MRD 분석 소프트웨어는 진단 시에 우세한 IgH clonal gene rearrangement로 확인된 염기서열을 이용하여, 추적조사에서 확인된 염기서열 가닥들과 대조하는 군집 분석 알고리즘을 통해 잔존하는 혈액 종양 세포의 비율을 추산한다. MRD가 확인된 검체의 분석 결과에서는 추적 대상의 염기서열 대비 Exact match와 1 Mismatch, 2 Mismatch의 조건으로 존재하는 염기서열 개수와 비유를 판독에 참고할 수 있다. 반면에 MRD가 발견되지 않은 검체의 분석 결과에서는 0.1~0.0001% 민감도 범위에서 MRD가 존재하지 않을 가능성을 신뢰구간으로 확인할 수 있으며, 일반적으로 사용하는 95% 신뢰구간을 기준으로 판독에 적용할 수 있다. [Fig. 7]



[Fig. 7] LymphoTrack MRD 분석 소프트웨어 결과. Detected(좌), Not detected(우)[2]



[참고문헌]
[1] P. W. Raess and A. Bagg. The Role of Molecular Pathology in the Diagnosis of Cutaneous Lymphomas. Pathology Research International doi:10.1155/2012/913523
[2] ㈜다우바이오메디카 제공
[3] Maria Arcila. NGS-Based Clonality Testing Assessing Clonality Status, Somatic Hypermutation and Monitoring Minimum Residual Disease (MRD). AMP WEBINAR 2017.
[4] Chatree Chai-Adisaksopha and Jennifer R. Brown. FCR achieves long-term durable remissions in patients with IGHV-mutated CLL. Blood 2017 130:2278-2282.



급성림프모구백혈병의 미세잔존질환 추적을 위한 면역글로불린재배열 분석의 이용
김명신 (가톨릭의대 서울성모병원 진단검사의학과)

미세잔존질환(Minimal Residual Disease, MRD)은 혈액종양의 예후를 예측하는데 매우 중요한 역할을 한다. 면역글로불린재배열(Immunoglobulin gene rearrangement)을 이용한 MRD 추적 검사는 여러 림프구성 혈액종양에 사용할 수 있으며 최근 차세대염기서열분석법(Next-Generation Sequencing, NGS)으로도 효율적으로 이를 분석할 수 있게 되었다. NGS는 예민도가 높고 기존에 사용되고 있는 유세포분석법이나 정량PCR법에 비하여 검사실간 표준화가 가능하기 때문에 임상검사실에서도 쉽게 이용할 수 있다. 서울성모병원 진단검사의학과에서는 NGS를 이용하여 B세포 급성림프모구백혈병(Precursor B-acute Lymphoblastic Leukemia, B-ALL)에서 MRD 분석을 시행하고 이의 임상적용을 위해 고려해야 할 점들을 정리하여 보고하였다.[1] 연구는 47명의 B-ALL 환자에서 얻은 74개의 골수 검체를 대상으로 수행하였고, InVivoScribe사의 LymphoTrack® IGH FR1/2/3 assay panel과 IGK assay panel을 사용하여 진단 시 클론성 재배열과 MRD를 분석하였다. 분석 프로그램은 LymphoTrack®Dx Assay와 Vidjil platform 두 가지를 사용하였다. FR1, FR2, FR3 primer를 순차적으로 적용하였을 때, 모든 B-ALL환자에서 IGH clonality를 검출할 수 있고 정량은 9.47%–96.77%의 분포를 보였다. IGK clonality는 70%의 환자에서 관찰되었고 IGH clonal burden이 낮은 환자에서 IGK clonal burden이 높게 측정되는 경우 MRD 추적에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각되었다. IGH clonal burden은 기존의 MRD 지표인 골수 모세포 비율(%), 종양특이 융합유전자 정량(BCR-ABL1, ETV6-RUNX1) 및 유세포분석법과 잘 일치하였다. [그림 1] 

 

[그림 1] IGH clinal burden과 골수 모세포 비율 및 융합유전자 정량과의 상관성 분석

각각의 클론은 치료에 서로 다르게 반응하며 진단 시 미량으로 존재하던 IGH clone이 질병 재발 시에 증가하여 마치 새로운 클론이 나타난 것처럼 보이는 경우도 관찰되었다. [그림 2B의 Clone3, 2D의 Clone2S] IGH clonal burden은 MRD를 정확히 분석할 수 있을 뿐만 아니라 추가적으로 IGH rearrangement의 Repertoire diversity를 분석할 수 있어 정상 면역기능 회복에 대한 정보를 동시에 얻을 수 있는 장점이 있다. [그림 2] 
 


[그림 2] B-ALL 환자에서 치료 후 클론별 IGH clonal burden 및 repertoire 변화
 
MRD 양성인 환자에서는 강도 높은 치료를 해야 한다는 것은 이미 여러 연구에서 밝혀진 바 있으며 MRD 추적에는 민감도가 (<1/10-4, 0.01%) 매우 높은 검사 방법을 사용해야 한다. NGS를 이용한 면역글로불린 클론성 분석은 B-ALL 환자에서 좋은 MRD 추적 검사법으로 빠른 시기에 임상검사로서 환자들의 치료방향 설정에 이용할 수 있기를 기대한다. 



[참고문헌]
[1] Jo I, Chung NG, Lee S et al. Considerations for monitoring minimal residual disease using immunoglobulin clonality in patients with precursor B-cell lymphoblastic leukemia. Clin Chim Acta 2019;488:81–89.
[2] Berry DA, Zhou S, Higley H et al. Association of minimal residual disease with clinical outcome in pediatric and adult acute lymphoblastic leukemia: A Meta-analysis. JAMA Oncol 2017;3:e170580.



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